El Servei d'Anatomia Patològica de l'Hospital Trueta ofereix una àmplia cartera de serveis que avarca des de les tècniques més senzilles fins a les més complexes que requereixen d'una alta especialització.

El Servei facilitarà l’enviament a altres Centres de referència d’aquelles proves que no realitzi per no disposar de la tecnologia especifica.

A diferència dels hospitals comarcals de la demarcació de Girona, el Servei d'Anatomia Patològica del Trueta ofereix una major complexitat en el maneig macroscòpic, microscòpic i diagnòstic de biòpsies i peces quirúrgiques derivades de la cirurgia d'alta complexitat i de referència del propi Hospital, sobretot de la cirurgia oncològica:

• Recte
• Gastroesofágica
• Hepatobiliar i pancreàtica
• Maxil·lofacial
• Neurocirurgia
• Cirurgia toràcica
• Cirurgia otorinolaringològica
• Cirurgia d'òrgans endocrins
• Cirurgia de rescat post tractament neoadjuvant
• Cirurgia de cistoprostatectomia radical
• Cirurgia oncològica ginecològica

Forma part de la Unitat de Diagnòstic Molecular i Medicina Personalitzada (UDMMP) de l’Hospital Universitari de Girona Dr. Josep Trueta i ofereix estudis de gens relacionats amb el càncer per seqüenciació Sanger i per seqüenciació massiva d’última generació (NGS), tant en mostres tumorals en blocs de parafina com en plasma.

A més, és el centre de referència de la Regió Sanitària Girona per a la determinació del virus del papil·loma humà (VPH) i disposa d'un banc de mostres tumorals de diferents localitzacions en un congelador de -80º dins el Banc de Tumors, node del Biobanc IDIBGI i integrat a la Xarxa de Bancs de Tumors de Catalunya.

Des de l'any 2016 i en el marc de l'aliança estratègica entre l'ICS Girona i l'IAS, tota l'activitat d'anatomia patològica que generen l'Hospital Santa Caterina i l'Hospital Trueta es concentra a les instal·lacions del Trueta. L'ampliació del Servei ha permès aglutinar totes les autòpsies clíniques i assumir la pràctica totalitat dels estudis de càncer de mama que es realitzen a la Regió Sanitària Girona.

El Servei d'Anatomia Patològica de l'Hospital Trueta també dóna servei a l'Hospital de Campdevànol - Hospital Comarcal del Ripollès- i a la Clínica Salus Informorum de Banyoles.

En la seva cartera de serveis únics dins de la Regió cal destacar:

• 2 escàners de portaobjectes per a la digitalització de preparacions histològiques Panoramic 1000 DW FLAS IV BF.
• 1 escàner de portaobjectes per a la didigitalització de preparacions histològiques de fluorescència SCAN II 150 BF/FL.
• Anticossos inusuals per a l’estudi immunohistoquímic esdevenint centre de referència d’hematopatologia de l’Hospital de Palamós.
• Biòpsies miocàrdiques.
• Biòpsies pulmonars de malalties intersticials.
• Estudis intraoperatoris derivats de l’ecobroncoscòpia lineal (EBUS) i ecoendoscòpia digestiva (EUS).
• Estudis de microscòpia òptica i d’immunofluorescència per a patologia nefrològica i cutània.
• Estudis del gangli sentinella dels melanomes.
• Estudis del gangli sentinella de tumors ginecològics.
• Estudis del ganglis sentinelles per tècnica molecular OSNA (One-Step Nucleic Acid Amplification).
• Estudis dels gens HER2; Myc; BCL2 i BCL6 per Hibridació In Situ Fluorescent (FISH).
• Estudis de biomarcadors predictius de resposta terapèutica oncològica:
  • Immunohistoquimica per ALK i PDL1 en el càncer de pulmó.                  
  • Estudi mutacional de KRAS, NRAS i BRAF per al carcinoma colorectal amb la plataforma molecular Idylla.
  • Estudi mutacional d’EGFR en teixit tumoral amb PCR a temps real mitjançant la plataforma COBAS.
  • Estudi en plasma de l’ADN tumoral circulant del gen EGFR (“biòpsia líquida”)

• Estudis de clonalitat de malaltia limfoide amb reordenaments TCRβ, TCRγ, IgH i IgHκ-λ 
• Estudis moleculars de gens relacionats amb el càncer per seqüenciació massiva d’última generació (NGS), tant en mostres tumorals en blocs de parafina com en plasma.
  • AKT1, AKT3, ALK, APC, BRAF, BRCA1, BRCA2, CDKN2A, CTNNB1, DDR2, EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4, FGFR1, FGFR2, FGFR3, NF1, HRAS, JAK1, JAK2, KIT, KRAS, MAP2K1, MAP2K2, MET, MYC, NRAS, NTRK1, NTRK2, NTRK3, PDGFRA, PIK3CA, POLD1, POLE, PTEN, RB1, RET, ROS1, SLC34A2, SOX2, STK11, TERT, TP53. Addicionalment es cobreixen regions intròniques involucrades en fusions dels següents gens: ALK, BRAF, EGFR, FGFR1, FGFR2, FGFR3, RET i ROS1. 
• Estudis de mutacions dels gens POLE i RET per metodologia de seqüenciació Sanger.
• Detecció d’ADN del Virus del Papil·loma Humà (VPH) d’alt risc en mostres tissulars parafinades mitjançant tecnologia Cobas® HPV.

Al Servei d’Anatomia Patològica de l’Hospital Universitari de Girona  Dr. Josep Trueta es processen i diagnostiquen les següents mostres biològiques i s’apliquen en cada cas les tincions o tècniques adients segons els protocols establerts pel mateix Servei.

Les condicions de recollida i transport de les mostres estan recollides al document P-APA-006 “Protocol d’Identificació, fixació, envasat i trasllat de mostres de diagnòstic d’Anatomia Patològica”.

BIÒPSIES

Peces quirúrgiques i biòpsies intraoperatòries. Punchs de pell i falques cutànies, biòpsies d’ungles per a determinar la presència de fongs, biòpsies de lesions de mucosa orofaríngia i glàndules salivals menors per a estudi de la S. de Sjögren, biòpsies de quists i tumors de maxil·lars, biòpsies de foses nasals i si paranasals, biòpsies d’artèries temporals i plaques d’ateroma d’artèries carotídies, estudi de tromboèmbols arterials, biòpsies de còrnia i conjuntivals, biòpsies estereotàxiques de tumors cerebrals i lesions desmielinitzants del sistema nerviós central, biòpsies endoscòpiques del tracte digestiu i respiratori, biòpsies pleurals, biòpsies de pulmó per videotoracoscòpia de pneumopaties intersticials, nòduls pulmonars i emfisema bullós, biòpsies de ganglis mediastínics per mediastinoscòpia, biòpsies amb agulla gruixuda (BAG), cilindres i tru-cuts de lesions tumorals o pseudotumorals, biòpsies renals, biòpsies de múscul i nervi perifèric, biòpsies ganglionars i de moll d’òs, biòpsies hepàtiques, biòpsies de lesions tumorals o pseudotumorals del sistema esquelètic, biòpsies de bufeta urinària, biòpsies de pròstata per a screening de PSA, reseccions transuretrals de pròstata, biòpsies testiculars per a estudi d’infertilitat, legrats endometrials, biòpsies de pòlips endometrials per histeroscòpia, biòpsies de trompes uterines per lligadura de trompes, biòpsies de conductes deferents per esterilització masculina, biòpsies de cèrvix per a estudi de lesions associades a l’HPV.

El temps de resposta mesurat entre la recepció de la biòpsia i la validació de l’informe per part del patòleg varia segons la complexitat de la mostra que estableix l’aplicatiu ETPAT d’Anatomia Patològica: Biòpsies bàsiques i intermèdies <=10 dies; Complexes i d’Alta complexitat <=15 dies. Per disminuir els temps de demora el sistema de traçabilitat del Servei pot identificar les mostres preferents o urgents.

 

CITOLOGIES

Esputs, moc nasal, broncoaspirats (BAS), rentats bronquioloalveolars (BAL), citologies exfoliatives de líquids pleurals i ascítics peritoneals, rentats de sac de Douglas, citologies per raspallat de vies biliars i bronquis, citologies ginecològiques de cèrvix uterí i endometri, citologia de líquid cefaloraquidi i puncions aspiracions amb agulla fina (PAAF) de lesions nodulars, tumorals i pseudotumorals.

Estudis intraoperatoris derivats de l’ecobroncoscòpia lineal (EBUS) i ecoendoscòpia digestiva (EUS).

El temps de resposta mesurat entre la recepció de la mostra i la validació de l’informe per part del patòleg varia segons el tipus de citologia: Citologies ginecològiques <=20 dies; Citologies generals no ginecològiques i PAAFs <=10 dies. Per disminuir els temps de demora el sistema de traçabilitat del Servei pot identificar les citologies preferents o urgents.

 

AUTÒPSIES

Autòpsies clíniques, no judicials. Autòpsies clíniques d’adults, pediàtriques, perinatals i fetals, incloent les autòpsies fetals per interrupció legal de l’embaràs degudes a malformacions congènites, cromosomopaties, metabolopaties o risc matern.

El temps de resposta mesurat entre la recepció de la petició d’autòpsia i la validació de l’informe final definitiu per part del patòleg varia segons el tipus d’autòpsia: Autòpsia de fetus/nounats <=90 dies; Autòpsies d’adult:<=150 dies. Per disminuir els temps de demora el sistema de traçabilitat del Servei pot identificar les autòpsies que siguin preferents i que requereixin un informe més urgent.

En tot cas i, per mitigar aquesta demora, s’efectuarà un informe provisional amb les troballes macroscòpiques de l’autòpsia en un màxim de tres dies entre la recepció de la petició i la validació de l’informe.

 

TÈCNIQUES DE RUTINA I ESPECIALS

Hematoxilina-Eosina, Papanicolaou, Periòdic-Àcid-Shiff (PAS), PAS-Alfa-Amilasa, PAS-Blau Alcià, Blau Alcià, Ferro de Perls, Ferro Col·loïdal,  Giemsa, Mucicarmín de Mayer, Tricròmic de Masson, Reticulina de Gomori, Plata methenamina de Jones, Elàstiques de Verhoeff,  Orceïna,  Ziehl-Neelsen, Fite, Gram, Grocott, Roig Congo, Roig Congo amb Permanganat, Warthin-Starry,  Osmi. 

TÈCNIQUES IMMUNOHISTOQUÍMIQUES

Citoqueratina (CK)7,CK19, CK20, CKAE1/AE3, CK34ßE12, CK5/6, CKMNF-116, Desmina, Antigen Epitelial Ber EP4, Antigen Epitelial de Membrana (EMA), Proteïna Glial Fibril·lar Acidòfila (PGFA), Proteïna S-100, Vimentina, Actina de múscul llis (SMA), Miosina de múscul llis (SMM), Antigen carcinoembriogènic (CEA), Antigen relacionat a l’epiteli (MOC-31), Antigen relacionat amb el càncer de Mama (GCDFP15), Antigen Prostàtic específic (PSA), CA125, Antigen Hepatocític específic (Hepar-1), Tiroglobulina, Calcitonina, Col·lagen IV, Cromogranina, Sinaptofisina, Receptors d’estrògens, Receptors de Progesterona, HER-2 (HercepTest ™), p53, Ki-67, E-Cadherina, EGFR, HMB45, Melan-A, c-KIT, Pan-Melanoma, PIN-cocktail, MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, EBV-LMP1, Mieloperoxidasa, TdT, TTF-1, ALK1, Amiloide A, bcl-2, bcl-6, Calretinina, Ciclina D1, Citomegalovirus, CD1a,CD3,CD4, CD5, CD8,CD10, CD15, CD20,CD21, CD23, CD30, CD31, CD34, CD43, CD45, CD45R0, CD56,CD61, CD68, CD79a, CD99, CD138, p16, Calponina, MUM-1, h-caldesmon, Miogenina, Mamoglobina, Carcinoma de cèl·lules renals (RCC), Inhibina, N-Cadherina, D2-40, Fosfatasa Alcalina Placentària, α-1-Fetoproteïna, Gonadotrofina Coriònica Humana, CDX-2, WT1, Kappa,Lambda,Pax5,ZAP-70,Glicoforina C,ß-Catenina,Her-pes Virus Simplex 1,Napsina A,Factor XIII,HHV8. 

Aquests són alguns dels anticossos que realitzem, per conèixer la llista completa, contacteu amb el Servei d'Anatomia Patològica.

TÈCNIQUES IMMUNOFLUORESCÈNCIA DIRECTA

Aquesta metodologia s’utilitza per a la determinació de la presència d’immunocomplexos en les malalties ampul·loses de la pell i Glomerulonefritis, mitjançant anticossos marcats amb fluoresceïna de cadenes pesades d’immunoglobulines (IgA, IgG, IgM), cadenes lleugeres (Kappa, Lambda) i fraccions de complement (C3).

Les biòpsies a estudiar s’han de trametre en fresc, es congelen en isopentà, es tallen en un criòstat i s’examinen amb un microscopi de fluorescència.

 

TÈCNIQUES DE BIOLOGIA MOLECULAR

- Determinació de l’ADN del virus del Papil·loma Humà (VPH)

En el protocol de les activitats per al cribratge del càncer de coll uterí del Pla Director d’Oncologia del Servei Català de la Salut s’ofereix una prova de determinació del Virus del Papil·loma Humà (VPH) d’alt risc amb les següents indicacions: història de cribratge inadequat, ASC-US (dones amb lesions de diagnòstic incert) i en el seguiment post-conització de lesions intraepitelials.

Actualment al Servei d’Anatomia Patològica i com a centre de referència de l’Àrea Sanitària de Girona, s’utilitza el sistema Cobas 4800 que detecta el VPH d’alt risc.

El temps de resposta mesurat entre la recepció de la mostra i la validació de l’informe ha de ser <=20 dies.

- Estudis de clonalitat limfoide

Reordenaments TCRβ, TCRγ, IgH i IgHκ-λ 

 -Tècnica d’hibridització in situ amb Fluoresceïna (FISH) en el càncer de mama i patologia limfoide

Estudi dels gens HER2, Myc, BCL2 i BCL6

-Estudi dels ganglis sentinelles pel Sistema OSNA (One Step Nucleic Acid Amplification) (Sysmex®).

Tècnica d’anàlisi molecular del RNAm específic de la citoqueratina 19 de les cèl·lules tumorals del càncer de mama i endometri mitjançant RT-LAMP (reverse transcription-loop mediated isothermal amplification).

L’estudi del gangli sentinella del càncer de mama i endometri es realitza habitualment mitjançant la pràctica intraoperatòria d’impremtes a nivell de la superfície de tall del gangli i estudi citològic per a determinar la presència o absència de cèl·lules tumorals. Si el resultat és positiu el cirurgià procedeix a fer limfadenectomies més extenses. Si és negatiu es realitza un estudi diferit del gangli amb talls seriats i estudi immunohistoquímic per a citoqueratines. En l’estudi diferit es detecten micrometàstasis  en un 12-15% dels casos analitzats, en els que suposa una  reintervenció.

Amb l’aplicació del Sistema OSNA en l’estudi del gangli sentinella es fa una determinació quantitativa del RNAm de la citoqueratina 19 de tot el gangli mitjançant l’homogeneïtzació del mateix, la qual cosa permet establir diferents resultats (aïllades cèl·lules tumorals, micrometàstasis i macrometàstasis), que comporten actituds terapèutiques diferenciades.

Amb la implementació d’aquesta tècnica un percentatge significatiu de pacients s’estalvien una segona intervenció quirúrgica i una comorbilitat associada.

-Estudi mutacional mitjançant PCR i  seqüenciació directe Sanger

Gen POLE: Detecció d’onze mutacions patogèniques en els exons: 9, 11, 13 i 14 (NM_006231; GRCh37).

Gen RET: Detecció de mutacions patogèniques en els exons 14 i 15.

 

-Anàlisi molecular de tumors amb tecnologia Next Generation Sequencing (NGS).

 

Panell de disseny propi que  permet cobrir la major part de regions codificants en gens d’interès així com les regions implicades en les fusions més importants. També permet analitzar de manera eficient CNAs i determinar amplificacions i delecions en els gens estudiats. En ser un panell propi permet de manera àgil anar afegint regions d’interès noves i optimitzar regions conegudes.

S’ha  posat a punt tot un pipeline d’anàlisis focalitzat en l’anàlisi de senyals d’origen somàtic, senyals estructurals i CNAs. El procés intenta ser automàtic i complet fins a generar un informe final. L’informe final conté informació de les variants trobades dividides en tres grups, les variants amb implicació terapèutica directe, les variants amb implicació clínica i les variants rares de baixa freqüència que puguin tenir interès

en la recerca. Addicionalment s’inclou informació de la qualitat de la seqüenciació de les regions d’interès i de les dianes terapèutiques incloses en la anàlisis.

Aquest panel cobreix completament les regions exòniques dels següents gens:AKT1, AKT3, ALK, APC, BRAF, BRCA1, BRCA2, CDKN2A, CTNNB1, DDR2, EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4, FGFR1, FGFR2, FGFR3, NF1, HRAS, JAK1, JAK2, KIT, KRAS, MAP2K1, MAP2K2, MET, MYC, NRAS, NTRK1, NTRK2, NTRK3, PDGFRA, PIK3CA, POLD1, POLE, PTEN, RB1, RET, ROS1, SLC34A2, SOX2, STK11, TERT, TP53. Addicionalment es cobreixen regions intròniques involucrades en fusions dels següents gens: ALK, BRAF, EGFR, FGFR1, FGFR2, FGFR3, RET i ROS1.

El protocol de llibreries utilitzat és el SureSelectXT HS Target Enrichment System (Agilent Technologies). Aquest protocol parteix d’un mínim de 50ng d'ADN de doble cadena i és apte per a mostres amb un alt nivell de degradació com les provinents de FFPE. La fragmentació de l’ADN és de caràcter enzimàtic; seguidament hi ha un procés de reparació dels extrems, adenilació, lligació dels adaptadors específics i amplificació conjuntament amb l’indexing de cada mostra. Després d’un punt de control  (TapeStation), els fragments obtinguts són hibridats amb les sondes de RNA biotinilades corresponents a les regions d’interès del panell dissenyat. L’enriquiment de les regions d’interès es realitza a partir de la química de captura d’Agilent Technologies, SureSelect. Seguidament, es realitza la captura a partir de les boles d’estreptavidina i s’amplifica el DNA capturat. Finalment es realitza l’últim punt de control per tal d’obtenir els perfils de llibreria esperats i la molaritat de cada mostra. Les llibreries resultants són multiplexades i seqüenciades en l’instrument MiSeq (Illumina) a partir de la química basada en l’amplificació clonal i la seqüenciació per síntesi.

L’anàlisi es realitza mitjançant el software d’anàlisi bioinformàtica desenvolupat i validat internament. Els extrems dels reads son processats per eliminar bases de baixa qualitat i adaptadors utilitzant l’eina fastp. L’alineament dels reads al genoma de referència (GRCh37/hg19) es realitza amb el programa BWA-MEM i la posterior eliminació de reads duplicats es porta a terme amb l’eina Picard. La detecció de SNVs i INDELs (1-50 pb) es realitza combinant els resultats de les eines Mutect2 i FreeBayes. Les variants estructurals (SV) majors de 50 pb són detectades mitjançant el software Manta. La detecció d’alteracions de número de còpia (CNAs) es realitza mitjançant els programes CNVkit i PureCN. L’anotació de variants a un nivell general es realitza amb el Variant Effect Predictor (VEP) utilitzant la nomenclatura estàndard HGVS en base a les isoformes canòniques dels gens del panell. Per cada variant s’incorpora informació dels predictors de patogenicitat Polyphen2, SIFT, MutationTaster i Provean i les variants d’splicing s’analitzen amb l’SpliceAI i el MaxEntScan. Les freqüències

poblacionals s’anoten amb el gnomAD, l’ExAC i 1000Genomes. L’anotació de variants amb evidència clínica en càncer es realitza amb les últimes versions disponibles del CIViC i el CGI. Les fusions s’anoten amb la base de dades chimerKB. La classificació de variants reportades es realitza a tres nivells, segons evidència clínica i tractament: (i) variants clíniques amb tractament associat (ii) altres variants (comunes i rares) amb evidència d’interacció/resistència al tractament, (iii) variants rares (MAF < 1%) sense evidència clínica. Addicionalment, es crea un registre amb totes les variants identificades per cada mostra i s’actualitza la base de dades interna, possibilitant una futura re-interpretació i/o classificació degut a noves evidències científiques.

La detecció de senyals en cèl·lula somàtica es veu afectat per l’enriquiment de la mostra en aquest tipus de cèl·lula, és per això que es recomana una % de cèl·lula somàtica que sigui superior al 10% i en general quan més enriquida estigui la mostra millor. Les senyals de fusió i en general senyals estructurals i CNAs es veuen encara més afectades per l’enriquiment clonal de la mostra i per tant en mostres poc enriquides no es pot assegurar la seva detecció.